Testes VIH

14-03-2010 12:27

Testes VIH

Estar informado acerca da infecção VIH é o pré-requisito para tirar o melhor partido das últimas opções terapêuticas disponíveis. É por isso recomendado, após uma potencial exposição, recorrer ao aconselhamento e fazer testes ao VIH. Em contraste com o passado, os testes ao VIH tem actualmente uma grande relevância em termos terapêuticos. Começar a HAART na altura certa pode aumentar a qualidade de vida e prolongar consideravelmente o tempo de vida. Consequentemente como resultado, na década passada ocorreu uma alteração na atitude relativa aos testes ao VIH. Enquanto um teste ao VIH era anteriormente visto primeiramente como um atentado aos direitos civis do indivíduo testado, o prestador de serviços, na era da HAART, é obrigado a aconselhar se necessário, enfaticamente – o teste ao VIH de modo a que doente possa beneficiar de uma óptima manutenção da infecção. Um teste ao VIH pode também ser do interesse de uma terceira pessoa; exemplos são os testes de um doente tipo após picada com agulha ou análises a grávidas.

Se um doente sofre de uma possível doença relacionada com a SIDA, o diagnóstico ou exclusão da infecção por VIH dá pistas importantes para mais diagnósticos e terapêuticas de manutenção. Na maioria dos casos isto significa diagnosticar uma infecção por VIH estabelecida, que o doente já tem há algum tempo (vários anos). Casos especiais que são suspeitos de infecções primárias agudas ou de infecções por transmissão vertical, necessitam de um tipo particular de estratégia de testagem (ver abaixo).

Além da utilização para diagnóstico, os testes ao VIH são usados em larga escala na análise de sangue de dadores, derivados de sangue e transplante de órgãos para garantir a sua segurança, bem como (muitas vezes de uma forma anónima) para vigilância epidemiológica (ONUSIDA, 1997a and 2001).

Como Testar

O diagnóstico de uma infecção por VIH é normalmente feito indirectamente, i.e. através da demonstração da presença de anticorpos específicos do vírus (Gürtle 1996). Estes são encontrados virtualmente em 100% dos infectados com VIH e constituem um marcador da resposta imunitária humoral contra o agente. Em contraste com muitos outros vírus, os anticorpos não têm nenhum efeito imunoprotector que leve a imunidade. A sua presença equivale à presença de uma infecção por VIH crónica e activa. Casos em que não se detectam persistentemente anticorpos contra o VIH apesar dos indivíduos estarem infectados por VIH são raros e até agora tiveram muito pouca ou nenhuma influência na prática clínica (Connick, 2005). No entanto, isto pode mudar no futuro (Kassutto 2005).

Além do diagnóstico indirecto baseado na detecção de anticorpos, um diagnóstico directo da infecção por VIH é também possível: quer pela demonstração da presença de vírus infecciosos (usando cultura celular – isto é apenas possível laboratórios de pelo menos nível de segurança três), de antigénios virais (ELISA antigénio p24) ou de ácido nucleico viral (i.e. genoma viral); o último é também chamado teste aos ácidos nucleicos (NAT). A detecção do genoma viral é nos dias de hoje o mais frequentemente utilizado, pois não necessita de um laboratório de segurança, é mais sensível do que a detecção de antigénio e permite a quantificação.

Para determinar o estado de infecção de um doente, a detecção directa do vírus por testes qualitativos (fornecendo uma resposta sim/não) é apenas útil em certas circunstâncias; como suspeita de infecção primária ou no caso de recém-nascidos de mães infectadas por VIH (para mais detalhes ver à frente). No entanto testes quantitativos de genoma viral ganharam uma grande importância: a determinação da chamada "carga viral", i.e. a concentração de RNA viral no plasma, tornou-se uma ferramenta indispensável para guiar a terapêutica anti-retroviral.

O termo "teste ao VIH" (ainda ocasionalmente mas incorrectamente referido como "teste à SIDA"), é no entanto, quase sempre referente a testes de detecção de anticorpos específicos para o VIH como um marcador da infecção.

Diagnóstico de anticorpos para o VIH

Para a detecção de anticorpos contra o VIH é necessária a disponibilidade de pelo menos dois tipos diferentes de testes:

1. Um teste de pesquisa e
2. pelo menos um teste de confirmação.

É importante notar que duas colheitas diferentes do mesmo doente devem ser testadas antes de confirmar o diagnóstico (ver abaixo).

A maioria dos testes de pesquisa são baseados no princípio do ELISA (enzyme linked immuno sorbent assay – ensaio imunoenzimático) ou outros, semelhantes (UNAIDS, 1997b). Os testes de pesquisa devem ser extremamente sensíveis para minimizar a possibilidade de resultados falsos-negativos. Isto significa que estes testes têm de ser capazes de detectar anticorpos de baixa avidez encontrados por exemplo no início de uma infecção primária. Têm também de ser capazes de detectar anticorpos contra os dois tipos de VIH (VIH-1, VIH-2) e grupos (VIH-1-N, VIH-1-O, VIH-1-M) (ONUSIDA/OMS, 1992 and 1997).

Se o resultado da pesquisa for positivo, tem de ser confirmado pelo menos por um teste de confirmação. Para este fim, alguns países como a Alemanha e os Estados Unidos prescrevem o uso do chamado Western blot ou ensaios de imunofluorescência (IFT ou IFA). Noutros, como o Reino Unido, a confirmação pode ser alcançada com diferentes testes aplicados seguindo uma determinada sequência na forma de um algoritmo – por exemplo, o uso de ELISA’s mais específicos. Este último método não é inferior ao de confirmação por Western blot e de facto tem várias vantagens, como ser mais barato e mais objectivo (Tamashiro 1993).

A Organização Mundial de Saúde recomenda a seguinte estratégia para os países com fracos recursos (OMS1992):

· Diagnóstico numa pessoa saudável quando a prevalência na população em geral é < 10 %: três análises imunológicas seguidas.

· Diagnósico numa pessoa saudável quando a prevalência na população em geral é > 10 %, ou numa pessoa assintomática : duas análises imunológicas seguidas

· Rastreio nas dádivas de sangue: uma simples análise imunológica (salvo se o dador de sangue for informado do resultado).

Testes de rastreio por ELISA

Muitos dos testes comerciais de ELISA estão disponíveis em placas de titulação de 96 poços. Apesar do teste poder ser realizado totalmente de forma manual, pode também ser feito de forma automática e por isso é mais seguro e económico para testar um grande número de amostras de doentes. Vários outros dispositivos baseados em formatos similares estão também disponíveis, muitas vezes realizados por máquinas totalmente automatizadas para as pipetagens e para a análise.

Diferentes "formatos" de ELISA podem ser distinguidos; são todos baseados no princípio de uma reacção específica antigénio-anticorpo. Inicialmente era utilizado o "vírus completo" VIH como antigénio obtido de culturas celulares (testes de 1^a geração); nos dias de hoje são empregues uma mistura de proteínas virais recombinantes ou péptidos sintéticos representado os epitopos imunodominantes (testes de 2^ae seguintes gerações).

De modo a evitar não incluir certas as estirpes virais, é importante saber até que ponto é que os antigénios usados são capazes de detectar anticorpos dirigidos contra os potenciais tipos de vírus (VIH-1, VIH -2) e grupos (VIH-1-N, VIH -1-O, VIH -1-M). Por exemplo um doente que estão infectados com VIH-2 na África Ocidental mas que é apenas testados para os anticorpos contra o VIH-1. Os anticorpos HIV-2 podem não ser detectados e a infecção pode não ser diagnosticada. No entanto, devido a uma maior ou menor reactividade cruzada, uma verdadeira diferenciação serológica entre as infecções VIH-1 e VIH-2 só é possível utilizando testes especiais e se necessário tem de ser discutido directamente com o laboratório.

Na maioria dos testes ELISA, o antigénio viral está ligado à chamada fase sólida (por exemplo no fundo dos poços de uma placa de titulação). Após a adição do soro do doente contendo anticorpos específicos contra esses antigénios, ocorrerá a ligação antigénio-anticorpo. Um passo de lavagem assegura que são removidos todos os constituintes do soro não ligados, incluindo todos os anticorpos que não reconheceram o antigénio viral.

Se o anticorpo se ligar ao antigénio viral, é depois detectado através da adição do "conjugado" marcado enzimaticamente. Este conjugado pode ser ou um segundo anticorpo por exemplo anticorpo de cabra dirigido contra moléculas de anticorpos humanos (ensaio "antiglobulinas") ou contra um antigénio viral ligado a uma molécula de enzima (muitas vezes o mesmo que estava ligado à fase sólida: "imunométrico" ou ensaio de sanduíche; testes de 3^a geração). A vantagem dos ensaios "imunométricos" é que podem detectar anticorpos de todas as classes (incluindo os anticorpos IgM "precoces" que não têm um papel importante na infecção VIH). De novo, um passo de lavagem assegura que todo o conjugado que não se ligou seja removido.

Finalmente o substrato é adicionado. Se no passo anterior o conjugado se ligou, este substrato é convertido por acção da enzima contida no conjugado. Isto causa alteração de cor; a intensidade ("densidade óptica", D. O.) desta reacção de coloração é medida e é proporcional à actividade do anticorpo na amostra. Controlos positivos e negativos são incluídos em cada teste e os valores de D. O. obtidos com eles são muitas vezes utilizados para calcular os valores limite dos testes (i.e. valores de D. O. utilizados para distinguir valores negativos e positivos).

Um outro método usado com frequência é o MEIA (microparticle enzyme immunoassay). É baseado no mesmo princípio do ELISA; contudo, a “fase sólida” está na forma de micropartículas numa suspensão. A detecção faz-se pela agregação das partículas numa membrana e detecção da actividade emzimática, tal como no ELISA.

Um caso especial é o ensaio de "competição". Nestes, anticorpos marcados enzimaticamente são adicionados à fase sólida juntamente com a amostra do doente. Estes anticorpos competem então com os anticorpos do doente pelos locais de ligação ao antigénio. Se o doente não tiver anticorpos contra o VIH, todos ou a maioria dos anticorpos marcados enzimaticamente ligar-se-ão, causando uma reacção de coloração intensa após a adição do substrato. E vice-versa: quanto mais específicos forem os anticorpos presentes na amostra do doente, mais fraca será a reacção de coloração. A intensidade da cor da reacção é portanto nversamente proporcional à actividade em anticorpos da amostra. Estes ensaios de "competição” são em geral altamente específicos.

Um caso especial são os ensaios “competitivos”. Aqui, anticorpos para o HIV marcados com uma enzima, são adicionados à fase sólida juntamente com o sangue do paciente. Estes anticorpos vão então competir com os anticorpos do paciente, pelos locais de ligação dos antigénios. Se o doente não tem anticorpos HIV, todos ou quase todos os anticorpos marcados com a enzima vão-se ligar, causando uma reacção colorimétrica intensa após adição do substrato. E vice-versa: quanto mais específicos forem os anticorpos presentes na amostra do paciente, mais fraca será a reacção colorimétrica. A intensidade da cor da reacção é por isso inversamente proporcional à actividade dos anticorpos na amostra. Estes ensaios “competitivos” são normalmente altamente específicos.

Os diferentes tipos de testes têm diferentes vantagens e desvantagens; é por isso importante saber o princípio de cada ensaio. Os chamados testes de anticorpos de 4^a geração combinam a detecção de anticorpos contra o VIH com a detecção do antigénio viral p24, de modo a detectar o antigénio na amostra de sangue antes da formação dos anticorpos e, portanto a reduzir o "período de janela" (ver a seguir) (Brust 2000).

A fiabilidade de um teste baseia-se na combinação de 2 factores: a sensibilidade e a especificidade do teste. A sensibilidade denota a capacidade do teste em identificar correctamente uma amostra positiva como positiva, enquanto a especificidade mede a habilidade de identificar correctamente uma amostra negativa como tal.

Testes de pesquisa são extremamente sensíveis (quase 100%), o que significa que mesmo para baixa actividade de anticorpos – por exemplo no início de uma infecção primária – estes são detectados. Uma elevada sensibilidade reduz a possibilidade de um resultado "falso-negativo" e consequentemente uma conclusão errada: "O doente não está infectado por VIH", quando de facto está. Sendo fornecido um teste de pesquisa adequado, um resultado negativo após seis ou mais meses de um risco potencial de infecção, significa, devido à elevada sensibilidade, que a possibilidade de infecção é virtualmente nula (Preiser 2000).

Os testes para o VIH vendidos pela primeira vez após 7 de Dezembro de 2003 foram sujeitos à nova legislação da União Europeia para os dispositivos de diagnóstico in vitro e têm que ter a marca CE. Nas condições que têm de ser preenchidas incluem-se 600 amostras VIH positivas, incluindo 200 amostras VIH-2 positivas, obtidas em diferentes estádios de infecção por VIH e doença, e todas têm de ser identificadas correctamente como positivas.

Os testes de rastreio têm de ser altamente sensíveis; qualquer falha a identificar um caso positivo pode ter consequências muito graves. Esta elevada sensibilidade, causa, no entanto, baixa especificidade. Isto significa que o resultado do teste pode ser ocasionalmente um "falso-positivo". O resultado do teste indica a presença de anticorpos contra o VIH e de facto algumas substâncias presentes na amostra podem erradamente ser identificadas como anticorpos para o VIH. Esses falsos-positivos podem ser causados por uma estimulação do sistema imunitário de algum tipo (infecções virais agudas, gravidez, imunizações, doenças auto-imunes). Os actuais testes de pesquisa para o VIH têm uma especificidade de pelo menos 99.5%; i.e. em 4,000 amostras VIH negativas testadas, um máximo de 20 pode ter um resultado falso-reactivo.

Devido à possibilidade de uma reactividade não específica inerente a qualquer ensaio, é preferível utilizar o termo "reactivo" – em vez de "positivo" – nos resultados dos testes de pesquisa evitando-se assim mal entendidos. Todos os testes de pesquisa com resultados reactivos têm de ser confirmados com um teste de confirmação no sentido de excluir um resultado “positivo” por reactividade não específica. Só então pode ser chamado de "teste de VIH positivo"!

Importante: Um teste de pesquisa reactivo não significa infecção por VIH! Apenas um teste de confirmação positivo permite o diagnóstico de uma infecção por VIH, e normalmente apenas esse resultado deve ser comunicado ao doente! É também importante colher uma segunda amostra dado que uma reactividade não específica pode ocorrer devido, por exemplo, ao acondicionamento da amostra de sangue ou que as amostras tenham sido incorrectamente etiquetadas ou trocadas antes da análise.

Outras causas potenciais de resultados falsos-positivos (ou também falsos-negativos) são erros que ocorrem no laboratório nas fases de pré ou pós análise. Ou também podem ocorrer erros causados por troca de amostras ou contaminação com amostras positivas, por exemplo por erros de pipetagem ou outros erros clássicos (catalogação incorrecta do tubo da amostra ou do pedido de análise, entrada incorrecta dos dados nos ficheiros do laboratório, etc.). Deve tomar-se muita atenção de modo a salvaguardar a qualidade das análises realizadas pelo laboratório!

Ensaio de confirmação por Western blot

O Western blot é uma metodologia normalmente utilizada para confirmar amostras com resultados reactivos no teste de pesquisa. O VIH é propagado em culturas celulares, crescido, purificado e desnaturado (i.e. separado nos seus constituintes). De seguida, as proteínas são separadas de acordo com o seu peso molecular por electroforese, e transferidas para uma membrana de nitro-celulose. A membrana é cortada em tiras. Para realizar o teste, a membrana é incubada com o soro do doente. Se o soro contiver anticorpos contra as várias proteínas virais, estes ligar-se-ão às áreas da tira para onde foram transferidos os antigénios. Se ocorrer uma reacção antigénio-anticorpo, esta é revelada usando um anticorpo secundário marcado enzimaticamente e o respectivo substrato, fazendo com que as chamadas "bandas" apareçam na tira teste.

As proteínas do VIH e as bandas correspondentes no Western blot são designadas por "p" (para proteína) ou "gp" (para glicoproteína), seguida pelo peso molecular relativo em kiloDaltons. As proteínas podem ser divididas (utilizando como exemplo o Western blot de VIH-1) em três grupos: as glicoproteínas Env ou do invólucro (gp41, gp120, gp160), as proteínas Gag ou nucleares (p18, p24/25, p55) e as proteínas Pol ou polimerase-endonuclease (p34, p40, p52, p68).

O Western blot é um ensaio de confirmação que só é realizado se a amostra for reactiva no teste de pesquisa. Tanto os Western blots de VIH-1 como os de VIH-2 estão disponíveis comercialmente. O resultado de um Western blot pode ser tanto positivo como negativo ou indeterminado (no caso de ter um padrão incompleto de bandas visíveis) o que pode reflectir uma reactividade no limite ou uma reactividade não específica.

Várias organizações desenvolveram diferentes critérios de interpretação dos resultados do Western blot de VIH. Para um resultado ser declarado como positivo para o Western blot, a Cruz Vermelha Americana exige pelo menos a presença de três bandas, uma de cada grupo (i.e. uma banda do Gag, uma do Pol e uma do Env). A US-American Food and Drug Administration (FDA) exige a presença das bandas da p24, p34, bem como a gp41 ou gp120/160 (Centers for Disease Control and Prevention, 1989). No entanto, de acordo com as recomendações da OMS, um Western blot pode ser declarado positivo se apenas duas bandas do Env forem detectadas. Na Alemanha, a norma 58969 parte 41 diz que (Deutsches Institut für Normung, 2000). Uma amostra de soro VIH é positiva se reagir apenas com uma das glicoproteínas virais e uma das outras proteínas virais. Todas os outros padrões de bandas específicas do vírus são olhados como questionáveis.

As desvantagens do Western blot são o seu preço relativamente alto, os procedimentos do teste, e a inevitável subjectividade aquando da leitura e interpretação dos resultados. Por estas razões muitos países preferem testes de confirmação que sigam algoritmos, consistindo numa combinação de diferentes ELISA ou testes rápidos com sensibilidades e especificidades bem definidas e avaliados num contexto relevante. Também deve saber-se que os testes de 4ª geração, nos quais são detectados anticorpos e antigénios os testes de confirmação podem não ser reactivos no período antes da formação de anticorpos, dado que eles detectam só anticorpos.

Para além da obrigatoriedade da salvaguarda de um teste de confirmação, por exemplo por Western blot, o diagnóstico serológico de uma infecção por VIH requer sempre a testagem de uma segunda amostra de sangue do doente, obtida independentemente da testada anteriormente. Se possível, o doente só deve ser informado do diagnóstico após a segunda amostra ser testada.

Testes Rápidos/Simples

Nos dias de hoje, há uma série de testes rápidos para o VIH disponíveis; são também referidos como " testes de "cabeceira" ou testes " rápidos/simples". Estes testes são baseados em um dos quatro princípios do imunodiagnóstico: aglutinação de partículas, imunodot (dipstick), imunofiltração ou imunocromatografia (Giles 1999, Branson 2000). Na maioria dos casos os resultados do teste estão disponíveis em 15 a 30 minutos; é frequente, poder ser utilizado sangue total ou obtido por capilaridade (obtido da ponta de um dedo ou do lobo da orelha), evitando-se assim o passo centrifugação necessário se a mostra de sangue for obtida por punção venosa.

Muitos dos testes rápidos contêm um controlo interno, por exemplo uma banda controlo indicando se a mostra e, se aplicável, os reagentes são adicionados correctamente. Se este controlo falhar, o resultado do teste não deve ser aceite (é importante evitar resultados falsos-negativos, quando por exemplo a amostra não foi adicionada ou se o tempo de reacção foi insuficiente até à leitura do resultado).

Esses testes rápidos podem ser úteis se o resultado for necessário rapidamente, por exemplo no serviço de urgência, antes de cirurgias de emergência, após picadas acidentais com agulhas e para minimizar a taxa de resultados de testes "não reclamados" (se o resultado só estiver disponível alguns dias depois, alguns dos testados não voltam para o receber). Os testes rápidos, são fáceis de fazer e necessitam de pouco equipamento, são também úteis nos países em desenvolvimento (Branson 2003; WHO 2004). No entanto esses testes devem preencher os requisitos básicos dos testes de pesquisa por ELISA (WHO/UNAIDS 1998). Nos países em desenvolvimento, um teste rápido deve idealmente ser apenas utilizado como um primeiro guia, e o doente deve ser retestado o mais rapidamente possível num laboratório de rotina. Os problemas encontrados mais frequentemente nos testes rápidos – para além da necessidade de treino adequado do pessoal – são a necessidade de aconselhar o doente antes do teste e obter o seu consentimento. Qualquer teste de VIH que possa ser realizado por leigos acarreta sempre a possibilidade de uma utilização errada (como testagem compulsiva de prisioneiros etc.).

Entretanto vários testes rápidos para o VIH foram licenciados pela FDA: OraQuick^® (OraSure Technologies, Pennsylvania, USA), Reveal^™ (MedMira Laboratories, Halifax, Nova Scotia), Uni-Gold Recombigen^™ HIV Test (Trinity Biotech, Ireland) e Murex single use diagnostic system (SUDS). Após experiências inquietantes (pelo menos cinco indivíduos infectados por VIH foram informados que o resultado reactivo do seu teste rápido era um falso-positivo, i.e. eram VIH negativos!) o Centers for Disease Control and Prevention (CDC) enfatizou recentemente a necessidade de um teste de confirmação adequado e, se necessário, testes de seguimento após 4 semanas (CDC 2004).

Tipos de amostra

Na maioria dos casos, soro, plasma em EDTA, e ocasionalmente sangue total são as amostras utilizadas para a pesquisa de anticorpos contra o VIH. Se o processamento da amostra for atrasado, poderá ser preferível remover o plasma ou soro dos constituintes crepusculares do sangue, uma vez que a hemólise pode interferir com vários testes.

As imunoglobulinas podem ainda ter de ser eluídas das gotas de sangue que são adicionadas ao papel de filtro e secas (Sherman 2005). A testagem dessas eluições na procura de anticorpos contra o VIH é utilizada para a pesquisa (anónima) em grávidas, e utilizando os testes em cartão Guthrie com gotas de sangue obtidas por rotina de recém-nascidos (cuja a prevalência de anticorpos espelha a da sua mãe). Nos países em desenvolvimento com poucas possibilidades de armazenamento e transporte refrigerado, as gotas de sangue seco podem ser uma ferramenta útil e barata para armazenamento e transporte. Uma vez totalmente seco, o sangue mesmo de doentes com VIH não constitui qualquer risco de infecção.

Alternativamente, podem também ser utilizados nalguns testes urina ou fluídos orais (exsudado oral, muitas vezes referido incorrectamente como "saliva") (Tamashiro 1994; King 2000). A FDA licenciou um teste rápido usando fluído oral para o diagnóstico da infecção VIH em Março de 2004; o mesmo ensaio, comercializado pela OraSure Technologies, estava licenciado desde Novembro de 2002 como um teste rápido para a detecção de anticorpos contra o VIH a partir de sangue total (ver a seguir). De acordo com a informação disponível este ensaio permite a detecção de anticorpos contra o VIH-1 ou VIH-2 com uma sensibilidade de 99.3 % e uma especificidade de 99.9 %.

Em certas circunstâncias, tais espécimes de origem não sanguínea tornam possível a testagem, uma vez que permitem uma colheita não invasiva. No entanto, as suas sensibilidades e especificidades são consideravelmente mais baixas. Por isso, o sangue continua a ser o tipo de espécime preferido. Independentemente do tipo de amostra utilizada, um teste com um resultado reactivo necessita sempre de um teste de confirmação.

Realização do teste

Os testes de anticorpos do VIH são dos melhores ensaios imunológicos disponíveis comercialmente. A sensibilidade (elevada sensibilidade - poucos resultados falsos-negativos) e a especificidade (elevada especificidade - poucos resultados falsos-positivos) são os dois parâmetros mais importantes; têm de ser calculadas individualmente para cada ensaio. No entanto, na prática não é tanto a sensibilidade e a especificidade de um teste que tem interesse mas antes o seu valor predictivo. Isto deve-se à falta de conhecimento do estado real do doente testado relativamente à infecção VIH e a necessidade de deduzir o seu estado a partir do resultado do teste. O valor predictivo positivo (PPV) é a probabilidade com que um doente com um teste com um resultado positivo está na realidade infectado e vice-versa, o valor predictivo negativo (NPV) é a probabilidade de um doente que teve um teste com um resultado negativo não estar realmente infectado.

A Tabela 1 explica a conecção entre os parâmetros.

TABELA 1: Tabela dois por dois.

		Resultado do teste
		Positivo	negativo
Verdadeiro estado do doente (ex. como determinado pelo teste referência)	positivo	verdadeiro-positivo	falso-negativo
	negativo	falso-positivo	verdadeiro-negativo

Sensibilidade
= número de verdadeiros-positivos / (número de verdadeiros-positivos + número falsos-negativos) = probabilidade de um teste com resultado positivo se o doente estiver infectado

Especificidade
= número de verdadeiros-negativos / (número de verdadeiros-negativos + número falsos-positivos) = probabilidade de um teste com resultado negativo se o doente não estiver infectado

Valor predictivo positivo (PPV)
= número de verdadeiros-positivos / (número de verdadeiros-positivos + número falsos-positivos)= probabilidade de um doente que testou positivo estar na realidade infectado

Valor predictivo negativo (NPV) = número de verdadeiros-negativos/ (número de verdadeiros-negativos + número falsos-negativos)
= probabilidade de um doente que testou negativo não estar realmente infectado

Por exemplo

1. Elevada prevalência do HIV: - 10% (IE 10 por cento)

Usando um teste com uma sensibilidade de 100% e uma especificidade de 99% (ie 1 falso positivo em cada 100) e rastreando 1.000 pessoas deve esperar-se o seguinte: Using a test with a sensitivity of 100 % and a specificity of 99 % (i.e. 1 false positive in 100), and screening 1,000 patients, one would expect to see the following:

· 100 positivos verdadeiros por cada 1.000

· 10 falsos positivos por 1.000

· Valor positivo previsível: 100 positivos verdadeiros-/-110 positivos no total= 91%

2. Baixa prevalência- 0,1% (ie 1 por 1.000)

Usando o mesmo teste (sensibilidade de 100% e especificidade de 99%) e rasterando 1.000 pessoas deve esperar-se o seguinte resultado:

· 1 positivo verdadeiro em cada 1.000

· 10 falsos positivos por 1.000

Valor positivo previsível: 1 positivo verdadeiro-/-11 positivos no total= 9,1%

Apesar disto inicialmente parecer pouco plausível, o valor predictivo de um teste não depende apenas da sensibilidade e da especificidade mas também da prevalência de VIH na população testada (i.e. a probabilidade pré-teste de se ser positivo ou negativo). A Figura 1 ilustra esta relação, usando populações fictícias com taxas de seroprevalência de VIH entre 0.02 % (ex. dadores de sangue Europeus) e de 20 % (ex. grupos sexualmente activos em países altamente endémicos). Pode ver-se que no anterior, a grande maioria dos testes com resultados positivos (ou mais correctamente, reactivos) são na verdade falsos-positivos: apenas 4.8 % desses com um teste positivo estão verdadeiramente infectados! Em contraste, 98 % dos testes com resultados positivos num grupo com elevada seroprevalência de 20 % são "verdadeiros" (é por isso que, de acordo com a OMS, os testes de confirmação podem excepcionalmente ser omitidos neste caso). Estes exemplos mostram a importância de estratégias de confirmação adequadas para todos os testes de pesquisa com resultados positivos!

Infelizmente, este fenómeno estatístico é frequentemente utilizado incorrectamente para propaganda: inevitavelmente, em dadores de sangue por ex. na Alemanha com uma baixa prevalência de VIH, na realidade, apenas uma pequena parte dos que têm um teste de pesquisa com um resultado reactivo estão na realidade infectados. No entanto, uma vez que a presença de reactividade tem de ser confirmada antes do doente ser informado, este fenómeno não deve ter consequências de maior: por isso se o Western blot não confirmar um resultado de ELISA reactivo, o doente ou dador de sangue não é simplesmente VIH – "positivo"! No entanto, isto é infelizmente muitas vezes utilizado para "provar" a alegada inutilidade dos testes ao VIH.

FIGURA 1: Ilustração da dependência do valor predictivo positivo (PPV) na taxa de seroprevalência na população testada, utilizando um teste de anticorpos com uma especificidade constante de 99.6 % (i.e. 4 resultados falsos-positivos por 1000 amostras testadas).

Quando testar

Após uma infecção, normalmente são necessárias três a doze semanas até que os anticorpos sejam detectáveis no indivíduo infectado. Por isso um teste ao VIH não deve ser realizado logo após um potencial contacto de risco, mesmo sabendo que os doentes podem, compreensivelmente, estar preocupados e ansiosos e por isso fazerem pressão para a realização do teste. É importante, no entanto, após uma exposição ocupacional, realizar o teste imediatamente de modo a confirmar a seronegatividade inicial no doente que se picou numa agulha! Em aproximadamente 5% dos novos indivíduos infectados levará aproximadamente mais de dois meses até que os anticorpos estejam formados. Deve realizar-se mais tarde outro teste.

As hipóteses de ter adquirido uma infecção por VIH aumenta se uma das seguintes questões for respondida positivamente:

· Teve relações sexuais sem usar preservativo com alguém infectado com VIH?

· Teve recentemente infecções sexualmente transmissíveis como clamídia ou gonorreia?

· Utilizou as mesmas seringas que outros toxicodependentes intravenosos (partilha de agulhas)?

· Recebeu uma transfusão e sangue ou de componentes sanguíneos entre 1978 e 1985?

· Teve relações sexuais com alguém que possa responder positivamente a uma destas perguntas?

Discute-se, cada vez mais, que o teste ao VIH "não deve ser encarado como um rótulo" (Manavi et al., 2005; Beckwith et al., 2005). Verificou-se que, com a deslocação epidemiológica para grupos não considerados formalmente como de "elevado risco", as infecções VIH podem não ser detectadas e que o aumento do aconselhamento pré-teste adequadopode desencorajar os prestadores de serviços a sugerir que os doentes sejam testados.

Problema: O "período de janela"

Um problema importante nos testes de anticorpos ao VIH é o chamado "período de janela". Este é um período de tempo que ocorre entre a altura em que o indivíduo adquiriu a infecção por VIH e o aparecimento de níveis detectáveis de anticorpos (Busch 1997). A passagem de anticorpos-negativos para anticorpos-positivos é chamada "seroconversão". Os testes de rastreio utilizados actualmente são capazes de identificar uma infecção por VIH seis semanas após uma infecção primária em aproximadamente 80 % e após 12 semanas em quase 100 % dos casos; a infecção só é detectada após três ou mesmo seis meses em casos muito raros. Os testes de rastreio de 4ª geração encurtam a duração do "período de janela" detectando simultaneamente anticorpos contra o VIH e antigénio p24 (Gürtler 1998, Ly 2001).

Se bem que estes testes de 4ª geração dêm um resultado positivo mais cedo no decurso de uma infecção primária, devido a razões metodológicas (Meier 2001), pode ocorrer um segundo "período de janela" mais tardio durante o qual o teste pode ainda ser não-reactivo.

No início da seroconversão os testes de rastreio por anticorpos são fracamente reactivos. O Western blot realizado para confirmação pode não mostrar nesta fase quaisquer bandas ou ter um padrão incompleto, sendo a banda da p24 normalmente a primeira a tornar-se visível. Os resultados obtidos nestes casos são muitas vez indistinguíveis dos dos doentes não infectados que contém um certo grau de reactividade não específica; aqui também são vistas ocasionalmente bandas p24 sozinhas. Isto ilustra claramente a importância de passar a informação clínica ao laboratório que irá realizar os testes (por ex. "suspeita de infecção primária", "rastreio de rotina" etc.)!

Esses casos ficam por esclarecer durante algum tempo, mas são resolvidos num curto período de tempo por testes de seguimento. Se se está lidar com uma seroconversão precoce, a seroreactividade aumentará significativamente uns dias depois, e em poucas semanas encontrar-se-à um padrão de bandas completo no Western blot. O aconselhamento para detecção directa do vírus, por exemplo por PCR, irá depender das circunstâncias individuais. Atenção: Profilaxia anti-retroviral pós-exposição fará com que a detecção directa do vírus seja mais difícil e atrasará potencialmente a seroconversão.

O aumento gradual da seroreactividade no decorrer da seroconversão pode ser utilizada para estudos epidemiológicos para medir a incidência do VIH (i.e. a taxa de novas infecções – em contraste com os testes padrão de anticorpos que medem a prevalência do VIH, i.e. infecções estabelecidas) – Há vários métodos em uso: combinando deliberadamente elevada sensibilidade com testes de anticorpos menos sensíveis, estas estratégias são capazes de estimar qual a proporção de amostras positivas em que ocorreu recentemente uma infecção primária (Parekh 2001; Constantine et al. 2003).

Ensaios «Detuned» – ao combinar deliberadamente testes de anticorpos muito sensíveis com outros menos sensíveis, é possível estimar que proporção das amostras positivas sofreram infecção primária recentemente. (Parekh 2001, Constantine 2003).

Ensaios de Avidez – ao tratar amostras com um agente que quebra as ligações antigénio-anticorpo mais fracas, como aquelas presentes em anticorpos imaturos no início da infecção, um coeficiente (índex de avidez) entre amostras tratadas e não tratadas pode indicar elevada avidez (infecção antiga) ou baixa avidez (infecção recente) (Suligoi 2002, Puchhammer-Stöckl 2005).

ELISA de captura de IgG BED – no início da infecção, a proporção de anticorpos específicos para o HIV em relação a outros anticorpos é baixa, enquanto que mais tarde é elevada. Ao capturar todas a moléculas de IgG, podemos detectar a proporção de anticorpos HIV-específicos ao detectar a quantidade de antigénio que se liga a estes. “BED” refere-se ao uso dos subtipos B, E e D nos ensaios comercialmente disponíveis (Dobbs, 2004).

Deve ser enfatizado que estes ensaios NÃO devem ser utilizados para o diagnóstico individual de uma infecção por HIV recente ou primária, mas sim para estudos epidemiológicos da incidência do HIV em populações.

Detecção directa de VIH

Uma infecção VIH pode também ser diagnosticada por detecção do vírus, em vez de indirectamente através da detecção de anticorpos. A detecção do vírus é apenas necessária em certas situações e, devido aos seus elevados custos, deve apenas ser realizada se for indicada.

O isolamento viral em culturas celulares é reservado para casos especiais, tem alguns riscos e requer o uso de um laboratório especilizado.

Alternativamente, estão disponíveis ensaios para a detecção do antigénio p24. Também os ELISA antigénio p24 foram, na sua generalidade, sendo substituídos por ensaios de detecção de ácidos nucleicos mais sensíveis, testes de rastreio de anticorpos de 4ª geração que incorporam detecção de antigénio p24 juntamente com a detecção de anticorpos contra o VIH, para encurtar o "período de janela" (ver atrás).

A detecção do ácido nucleico (i.e. do genoma viral) pode ser conseguida por diferentes técnicas laboratoriais. Estes métodos podem ser utilizados tanto para detectar cADN proviral nos leucócitos (o que requer amostras de sangue total em EDTA) ou ARN viral no compartimento livre de células (o que requer amostras de plasma ou de sangue total em EDTA).

Testes qualitativos para o genoma viral servem como marcadores da infecção. Isto complementa ou substitui os testes de anticorpos para o diagnóstico da infecção VIH em situações especiais (como suspeita de uma infecção primária muito recente: ausência de anticorpos durante o período de janela; recém-nascido de mãe infectada: presença de anticorpos maternos – ver abaixo).

A detecção quantitativa do ARN de VIH-1 no plasma é utilizada como um marcador prognóstico, para monitorizar a terapêutica e para estimar a infecciosidade (Berger 2002). Os testes mais sensíveis podem detectar um mínimo de aproximadamente 50 cópias/ml.

Vários testes comerciais e métodos "caseiros" estão disponíveis para a quantificação de ácidos nucleicos. Podem basear-se em tecnologias diferentes: reacção de polimerização em cadeia (PCR), branched DNA (b-DNA), amplificação de ácidos nucleicos baseada na sequência (NASBA) ou reacção de ligação em cadeia (LCR) ou detecção quantitativa da actividade da transcriptase reversa. O chamado teste de "carga viral" tornou-se uma ferramenta indispensável, tanto como marcador prognóstico como terapêutico.

No entanto, deve ser enfatizado que NENHUM teste de carga viral tem o propósito de ser usado como instrumento de diagnóstico. Recentemente, foi sugerido que este método podia ser uma vantagem como instrumento de triagem, usando amostras «pooled» (isto é, misturando amostras de vários indivíduos) ou não, para pacientes seronegativos em grupos de elevado risco (Pilcher 2004, Pilcher 2005).

Resultados dos testes

Resultados falsos-positivos por um correcto Western blot são muito raros. Um resultado confirmado positivo confirma a presença de anticorpos específicos para o VIH e por conseguinte, infecção VIH.

Um teste com resultado positivo (i.e. testes de rastreio e de confirmação positivos e troca de amostra excluída por teste de uma segunda amostra) significa que o indivíduo testado

· Está infectado com VIH (i.e. é portador do vírus que provoca a SIDA) - excepto em crianças muito jovens (ver a seguir);

· Pode infectar outros com VIH se não tomar precauções (ver capítulo xxx "Transmissão").

Um teste positivo NÃO significa que o indivíduo testado

· tenha SIDA;

· desenvolverá necessariamente SIDA.

Um teste negativo significa:

· que não foram detectados anticorpos contra o VIH no sangue do indivíduo na altura em que este foi testado.

Un teste negativo NÃO significa que:

· o indivíduo não está infectado com VIH (o teste pode ter sido efectuado durante o "período de janela");

· a pessoa testada é imune ou resistente ao VIH;

· a pessoa testada pode ter relações sexuais sem tomar precauções.

Deve notar-se que as pessoas durante o período de janela quando têm anticorpos negativos podem ter um virémia elevada e neste estadio serem muito contagiosos!

Para além do "período de janela", ou seja seis meses após uma possível exposição ao VIH, um teste de rastreio ao VIH raramente é um "falso-negativo". Por isso, um teste negativo significa que a pessoa não está infectada com VIH – assumindo sempre que entretanto não houve nova exposição.

Um resultado raramente "errado" no teste de confirmação significa:

· O teste não dá resultados sem erro. Como consequência, testes de seguimento devem ser realizados após um curto período de tempo. Particularmente em caso de sintomas clínicos como febre, adenopatias, rash ou sintomas neurológicos que podem ser suspeita de infecção aguda por VIH na qual a seroconversão só se iniciou nesse momento. A primeira reactividade de anticorpos é encontrada, no entanto o padrão completo de bandas do Western blot não está ainda presente. A seroconversão tende a seguir certos padrões; no Western blot, algumas bandas aparecem mais cedo (como a p24 ou gp120), e outras mais tarde.

· No caso de um Western blot sem erro e mesmo havendo suspeita de infecção aguda por razões clínicas e/ou anamnésticas, deve fazer-se detecção directa do vírus por PCR. O objectivo é detectar e tratar uma possível infecção aguda por VIH a tempo (ver também o capítulo "Infecção aguda por VIH"). Quanto mais cedo, melhor!

Atenção: No caso de suspeita de uma infecção primária recente um ensaio quantitativo de detecção de ARN é utilizado para a detecção do vírus no plasma (porque está normalmente mais disponível do que os PCRs para a detecção de ADN proviral nos leucócitos), deve ter-se em mente que esses testes podem ocasionalmente ter resultados falsos-positivos (Rich 1999). Esses resultados falsos-positivos – que podem ser típicos – indicam baixos níveis de ARN viral (normalmente não mais de 2000 cópias / ml) que é muito pouco provável que sejam encontrados numa verdadeira infecção aguda (que normalmente se apresenta com valores de "carga viral" elevados). No entanto, este problema causa por vezes confusões e diagnósticos errados.

Este fenómeno pode provavelmente ocorrer com qualquer um dos ensaios de carga viral disponíveis. Se não for reconhecido, o doente terá um diagnóstico errado de "infectado" com todas as suas consequências deletérias possíveis. Para evitar este problema (assumindo a não existência de erros na realização do teste e controlo de qualidade suficiente no laboratório), deve ser utilizado um teste para cADN proviral na fracção leucocitária do sangue; no entanto, isto é oferecido por muito poucos laboratórios.

Caso especial: Bebés nascidos de mães infectadas por VIH

Felizmente, que o risco de transmissão vertical do VIH (TV) (ver capítulo xxx "VIH e gravidez") é extremamente reduzido nos países industrializados e pode ser tão baixo como 1 %. No entanto o diagnóstico do VIH é essencial em todos os recém-nascidos expostos!

Em bebés nascidos de mães infectadas, os anticorpos contra o VIH são normalmente detectáveis até aos 12-15 meses de idade, e raramente para além dos 18 meses. Os anticorpos maternos são adquiridos passivamente pela criança, sendo transferidos para o feto através da placenta por volta da 30ª semana de gravidez. Estes anticorpos IgG maternos conferem alguma protecção imunológica contra muitas infecções mas no caso do VIH não têm qualquer eficácia protectora. Isto significa, no entanto, que todas as crianças de mães VIH-positivas, incluindo as que não estão infectadas (a maioria neste contexto), terão inicialmente resultados positivos no teste de anticorpos ao VIH, com decréscimo de reactividade ao longo do tempo, até se tornarem negativas após eliminação completa dos anticorpos maternos. O laboratório deve ter capacidade para indicar se o grau de reactividade está a diminuir mas a confirmação deve ter lugar mais tarde e não é diagnóstica.

Por isto, é necessário esperar – normalmente nove meses ou mais – por uma queda significativa nos níveis de anticorpos da criança; apenas o teste de várias amostras de sangue com intervalos regulares pode excluir com certeza a infecção VIH na criança (Newell 1995). Se os anticorpos persistirem numa criança exposta verticalmente para além da idade de 15 meses, a criança está geralmente infectada por VIH.

Hoje em dia o PCR permite um diagnóstico mais rápido. A infecção VIH na criança pode ser diagnosticada, ou felizmente, excluída por detecção directa do vírus. Até agora não é claro se a detecção (intracelular) do cADN proviral (dos leucócitos) ou (extracelular) do ARN do VIH (do plasma sanguíneo) é mais sensível. Em qualquer um dos casos, todos os testes com resultados positivos devem ser confirmados imediatamente com uma segunda amostra.

Importante: Muitos métodos de detecção de ácidos nucleicos de VIH podem falhar no caso de subtipos de VIH-1 "exóticos" (i.e. subtipos não-B e com VIH-2) e originar resultados falsos-negativos (Haas 1996). Para excluir esta hipótese, uma amostra maternal deve ser testada se necessário (por ex. se a mãe ou a sua fonte de infecção são de fora da Europa) para assegurar que o teste é capaz de detectar a estirpe em questão. Se a mãe tiver um resultado positivo por PCR com o mesmo teste, um resultado negativo na criança pode ser utilizado; por outro lado em laboratório especializados deve ser escolhido um métodos adequado ou têm que se limitar a testes de anticorpos com as suas limitações (ver acima). Apesar da preocupação com os métodos quantitativos de detecção de ARN, o problema dos resultados falsos baixos-positivos tem de ser reconhecido (ver acima)!

Em bebés expostos, são necessários pelos menos dois resultados negativos do teste de PCR para VIH para se poder excluir uma infecção por VIH: o primeiro entre a 1ª e a 4ª semana de vida, o segundo após a 4ª semana, só depois se pode fazer a exclusão de infecção (Rossi 1992). Além disso, o PCR deve ser realizado durante

—————

Voltar

Testes VIH

Contatos